白花蛇舌草载药血清对类风湿关节炎滑膜细胞增殖的影响

【摘要】目的 研究白花蛇舌草(hedyotic diffusa，HD)载药血清对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞增生的影响。方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法检测HDD载药血清对RA滑膜细胞的增生水平。结果 加入不同浓度HDD载药血清(1.25~5mol/L)培养RA滑膜细胞后,RA滑膜细胞的增生较未处理组受到抑制,且有一定的剂量和时间依赖性。结论 HDD载药血清可抑制类风湿关节炎滑膜细胞增生。

【关键词】白花蛇舌草载药血清;类风湿关节炎;细胞增生;滑膜

【Abstract】 Objective To investigate the effect of serum hedyotic diffusa decoction(HDD) on proliferation of synoviocytes in patiens with rheumatoid arthritis.Methods The level of cell proliferation of synoviocytes with serum hedyotic diffusa decoction(HDD) in patiens with rheumatoid arthritis were measured by monotetrazolium(MTT)colourmetric assay.Results Level of cell proliferation of serum hedyotic diffusa decoction-treated(1.25~5mol/L,HDD)was significantly decreased compared with corresponding non-treated group(P<0.01).Level of cell proliferation of serum hedyotic diffusa decoction-treated was dependent on certain dose and time.Conclusion Serum hedyotic diffusa decoction(HDD) can inhibite proliferation of synoviocytes in rheumatoid arthritis.

【Key words】 serum hedyotic diffusa decoction(HDD);rheumatoid arthritis;cell proliferation; synovial membrane

类风湿性关节炎(RA)是一种主要累及小关节的慢性自身免疫性疾病。主要表现为对称性的多关节的肿胀、疼痛、晨僵，体重减轻以及全身多系统的受累。RA的特征性改变为滑膜广泛增生，滑膜细胞数量明显增加并分泌大量细胞因子。主要病理特点是滑膜细胞增生,衬里层增厚,多种炎性细胞浸润,血管翳形成以及软骨和骨组织的破坏,最终导致关节畸形和功能丧失[1]。白花蛇舌草(hedyotic diffusa，HD)为茜草科耳草属植物,味苦、甘,性寒,归胃、肺、大肠、膀胱经,具有清热解毒、消痈散结、利尿除湿、活血止痛的功效。

白花蛇舌草临床作用广泛，包括调节免疫作用，抗肿瘤作用，抗菌作用，抗化学诱变作用，保肝利胆调节胃肠作用，增强肾上腺皮质功能,并有镇痛、镇静、催眠作用[2]，多用于阑尾炎、肝炎、附件炎等的治疗[3，4];外用治疮疖痈肿、毒蛇咬伤，现代研究将HD多用于恶性肿瘤的治疗和研究[5~11]。祖国医学以白花蛇舌草为主方治疗类风湿关节炎(RA)取得良好疗效[12~15]。RA滑膜组织表现的生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织的特性,但HD是否对RA有治疗作用,尚无报道。本实验用不同浓度的HDD载药血清处理原代培养的RA滑膜细胞,通过观察HDD载药血清对RA滑膜细胞增殖的影响，进一步研究其作用机制，探讨其治疗RA的可能性。为探索类风湿关节炎新的药物治疗提供理论基础。

1 材料与载药血清

1.1 实验材料

滑膜标本来自天津市天津医院风湿科和关节科2010年9月-2011年5月确诊RA膝关节、髋关节置换病人。RA病人诊断符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)1987年修订的分类标准。

1.2 主要设备和试剂

CO2培养箱(GALAXY，英国)、离心机(BECKMAN、美国)、倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)、酶标仪(Dynex MRX II型，美国)、96孔培养板(CORNNING，美国);D-MEM(Gibco，批号：6721953)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(中国医学科学院血研所科技公司，批号：200612)、Hank’s液(天津医院中心实验室自制)、胰蛋白酶(天津市灏洋生物制品有限责任公司)、MTT(Sigma 070612)、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：09096-09100)、白花蛇舌草(天津市中药饮片厂，产地：江西)。

1.3 白花蛇舌草载药血清

参考文献对胶原诱导性关节炎造模大鼠以HD分别5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml的浓度每天1次1ml灌胃，3周后处理获得血清，过滤除菌备用。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将关节置换病人滑膜标本用Hank’s液清洗3次，培养皿中用眼科剪剪至大小约1mm3后转移至50ml离心管，加入Ⅱ型胶原酶震荡仪消化1h，200目金属滤网过滤，1000r/min离心10min，弃上清。用含5%FBS、青霉素、链霉素双抗的D-MEM培养液置于37℃、5%CO2培养箱中培养，2~3天换液1次，选对数生长的细胞进行实验。

2.2 配液

各浓度组分别配制10%HDD载药血清的培养液;甲氨蝶呤(MTX)浓度为2.0mmol/L。

2.3 MTT检测实验步骤

(1)0.25%胰蛋白酶消化滑膜细胞，计数板计数调整细胞浓度为5×104/ml。(2)将滑膜细胞悬液接种于2块96孔培养板中，每孔100μl。37℃、5%CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁。(3)24h后倒置显微镜下观察细胞贴壁状态，吸弃旧培养液，加入10%HDD培养液,100μl/孔，每组设5个复孔，同时设置对照孔(加入等体积的培养基)、MTX组100μl/孔;(4)分别于48、96h后，倒置显微镜下观察细胞生长状态。并分别于各时间段后每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，37℃、5%CO2培养箱中孵育4h;(5)孵育结束弃上清液，各孔加入150μl的DMSO置微量振荡仪震荡10min使结晶充分溶解;(6)各时间段酶标仪测OD值(λ=490 nm)，记录结果。

2.4 统计学处理

全部数据采用x±s表示，SPSS13.0统计软件进行统计学分析，单因素方差分析(one-way ANOVA)组间比较，LSD(least significant difference)两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。抑制率=(对照组-药物组)÷对照组。

3 实验结果

见表1,表2。表1 HDD载药血清作用48h后对RA滑膜细胞增殖的影响表2 HDD载药血清作用96h后对RA滑膜细胞增殖的影响

4 讨论

类风湿性关节炎是一种复杂、多系统以关节的炎症损害为主要特点的自身免疫性疾病。而滑膜组织的大量增生是RA发病的一个显著特点。现代研究将HD多用于恶性肿瘤的治疗和研究，RA滑膜组织表现的生长及病理学行为在许多方面类似于肿瘤组织的特性,但HD是否对RA有治疗作用,尚无报道。本实验用不同浓度的HDD载药血清处理原代培养的RA滑膜细胞,通过观察HDD载药血清对RA滑膜细胞增殖的影响，观察到HD具有抑制RA滑膜细胞增殖的作用(P<0.05)，且有一定的剂量和时间依赖性，为进一步研究其作用机制，探讨其治疗RA的可能性提供理论基础。

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