黄芪防治实验性肝纤维化和肝硬化形成的再探讨

【摘要】目的 进一步探讨黄芪在肝纤维化和肝硬化形成过程中的防治作用。方法 52只Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为正常对照组（A组）、阳性对照组（B组）和黄芪干预组（C组，推荐剂量：1g/只大鼠）。采用CCl4造模，全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆汁酸 (BA)及白蛋白(A)水平；HE染色和VG染色观察肝脏病理及纤维化面积的变化,分析黄芪对肝功能及肝纤维化形成的影响。结果 肝硬化早期B组和C组的ALT、AST水平较A组明显增高（P<0.01）,而C组较B组损害较轻(P<0.05)，晚期B组和C组则无明显区别。肝硬化早期3组的血清白蛋白之间比较差异无显著性（P>0.05），而晚期B组和C组较A组明显下降（P<0.01），肝硬化早期3组的BA之间比较差异无显著性（P>0.05），而晚期B组、C组较A组明显升高（P<0.01）。肝硬化早期，3组的肝组织病理及胶原染色显示B组纤维化（S1～S3）较A组和C组明显（P<0.05），晚期B组和C组则无明显差别。结论 黄芪在肝病早期可起到延缓肝功能损害及纤维化的作用，但如不去除有害因子，则不能阻止肝病向晚期发展。

【关键词】黄芪；肝纤维化；肝硬化；SD大鼠

The effect of Astragalus mongholicus on cirrhotic formation in rats

LIANG Qi, CHEN Jian, XU San-rong, et al.Department of Gastroenterology, Kiangwu Hospital of Macao, 00853

[Abstract]Objective To investigate the effect of Astragalus mongholicus on SD rats’ hepatic inflammation and cirrhotic formation induced by CCl4. Methods 52 SD rats were divided into normal control group (group A), positive control group (group B) and Astragalus mongholicus intervening group (group C) randomly. Serum ALT, AST, bile acid (BA) and albumin levels were measured with automatic biochemistry analysator during the procedure. The changes of rats’ hepatic pathology and fibrosis stages were measured with HE and VG staining.Results ALT and AST levels were significantly higher in groups B and C than those in group A (P<0.01). Liver fibrosis score was lower in group C than that in group B in the early stage (P<0.05) while there was no statistical difference between the two groups in late stage (P>0.05). In the early stage of liver fibrosis, there was no significant difference of serum albumin levels among the three groups (P>0.05) while serum albumin levels of groups B and C were lower than that in group A (P<0.01). But there was no significant difference between groups B and C (P>0.05) in the late stage. BA levels didn’t show any statistical difference in the three groups in the early stage (P>0.05). But in the late stage, BA levels was higher in groups B and C than that in group A (P<0.01) while there was no significant difference between groups B and C (P>0.05). Liver fibrosis (S1～S3 ) was found in groups B and C while the latter was milder in fibrosis stage in the early stage (P<0.05), but there was no significant difference of fibrosis between groups B and C in the late stage.Conclusions Astragalus mongholicus might prevent and relieve the inflammatory impairment and fibrosis formation by CCl4 in SD rats in the early stage, but it could not hamper the deterioration of cirrhosis if without removing harmful factors.

[Key words]Astragalus mongholicus; hepatic fibrosis; hepatic cirrhosis; SD rats

中药黄芪有养血补气的作用，不少学者在动物实验和临床治疗中用到黄芪。国内有文献报道中药黄芪治疗肝硬化有较好的效果，起到改善肝功能及延缓肝纤维化的作用，本实验通过观察推荐剂量的黄芪对实验性肝硬化大鼠的肝功能和肝硬化形成的影响，进一步探讨黄芪在肝纤维化和肝硬化形成中的功效。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠52只，140～160g，2月龄，购自并饲养于复旦大学上海医学院实验动物中心（清洁级环境）。饲养环境： 4～6只/笼，标准饮食，自由饮水，室温（20±2）℃。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及肝硬化模型的建立 52只大鼠分3组，随机选取12只为正常对照组（A组），肝硬化对照组20只（B组）和黄芪干预组20只（C组）。开始2周A组大鼠自由饮用生活用水，B组及C组饮用含苯巴比妥钠的水（350mg/L），然后B、C两组大鼠背部皮下注射40%CCl4和橄榄油混合液（4ml/100g，首剂加倍），每周2次，同时给予C组大鼠黄芪灌胃[1g/（0.5ml·只·d）]，A组大鼠背部皮下注射等容积生理盐水橄榄油混合液[1，2]。至第6周末每组随机取出6只大鼠处死做相关检测，余下大鼠继续饲养至第12周末处死。

1.2.2 标本留取及测定 分别于第6周末及第12周末处死两批大鼠。在处死前1天将大鼠置于代谢笼中，空腹24h后称重，心脏采血5ml左右，4℃离心（1500转/min）5min，取血清，-20℃保存待检，打开大鼠腹腔，观察腹水的有无并测量，留取部分肝脏，10%中性福尔马林固定，制作石蜡切片。肝功能测定：全部样品均用全自动生化分析仪（Hitachi7170型全自动生化分析仪，Hitachi LTD Instruments TOKYO JAPAN，华山医院检验科提供）测定ALT、AST、BA及血清白蛋白。肝脏组织学分析：肝组织石蜡切片分别做HE及VG染色，然后进行肝组织的病理及半定量分析。所有组织切片HE染色后由一位资深病理学专家观片进行肝脏病理分级，具体标准如下[3，4]： G0： 肝细胞无损伤；G1：肝细胞损伤达肝腺泡Ⅲ区；G2：肝细胞损伤达肝腺泡Ⅱ区；G3：肝细胞损伤达肝腺泡Ⅰ区。肝脏纤维化程度（S）：S0：无纤维化；S1：纤维结缔组织只局限于汇管区或有汇管区扩大，有向小叶发展倾向；S2：纤维化结缔组织增生进入肝小叶2/3及有1级同样的改变；S3：纤维化结缔组织进入肝小叶达中央静脉周围；S4：纤维化结缔组织在全小叶多处弥漫增生，假小叶形成，并有S3同样的改变。半定量分析：采用OLYMPUS BH2型光学显微镜、PANASONIC MV-CP 410数码摄像机、细胞图像分析系统和医学图像分析软件（上海申腾信息技术有限公司）进行半定量分析。以72000μm2作为一个标准视野，每张切片随机选取5个不重复视野（40×），用图像分析软件测定胶原总面积，将呈现为红色的纤维区域（去除大血管）视作阳性目标，取平均值，以阳性面积与统计场总面积的比值作为肝组织的纤维化指数。

1.3 统计学处理 实验中的计量数据均以均数±标准差表示，使用SPSS11.0软件包进行统计，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 3组大鼠生存率和腹水量比较 12周末，A组大鼠无死亡；B组在第7周出现大鼠死亡，至12周末时共死亡5只，计算成活率为64.2%；C组在7周时也出现大鼠死亡，12周末时，共死亡4只，计算成活率为71.4%。12周末时，A组大鼠均无腹水，B组（n=9）和C组（n=10）存活大鼠均有腹水形成，见表1。表1 12周末3组大鼠的成活率和腹水量比较

2. 2 6周、12周末3组大鼠部分肝功能指标的比较 6周时，B组和C组的ALT、AST水平较A组明显增高（P<0.01），而C组相对于B组损害较轻(P<0.05)，12周时B组和C组则无明显差异。6周时，3组血清白蛋白差异无显著性（P>0.05），12周时则B组和CA组比较明显下降（P<0.01），6周时期，3组中BA之间比较差异无显著性（P>0.05），12周时则B组和C组较A组明显升高（P<0.01），见表2。表2 3组大鼠6周、12周末肝功能比较

2.3 6周末，3组大鼠肝细胞病变程度和纤维化分级期 A组无变化，B组肝细胞病变以G2S2为主（4/6），C组肝细胞病变以G1S1为主（4/6），见表3。表3 6周末3组大鼠肝细胞炎症和纤维化分级

2.4 12周末，3组大鼠肝细胞病变程度和纤维化分级 A组无变化，B、C组肝细胞病变G3S3～G3S4为主，见表4。表4 12周末3组大鼠肝细胞病变程度和纤维化分级

2.5 6周及12周末3组大鼠肝脏胶原面积比较 与A组比较，B组和C组大鼠肝脏胶原面积明显升高，6周时C组大鼠胶原面积明显低于B组，但在12周时两组差异无显著性，见表5。表5 3组大鼠6周、12周末肝脏胶原面积比较

3 讨论

中药黄芪是豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥块茎，其性味甘温，能益卫固表，利水消毒，托毒生肌。黄芪是一种补气中药材，被广泛用于肿瘤、糖尿病、肾脏疾病、肝脏疾病的治疗。

20世纪90年代以来，国内学者对黄芪在肝硬化和肝纤维化中的作用进行了大量的实验和临床研究。实验研究报告[5]，黄芪可以减少总胶原及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原在大鼠肝脏中的病理性沉积，使胶原含量明显下降，对实验性肝纤维化具有明显的治疗作用。实验还进一步提示，黄芪抗肝脏纤维化的作用机制与其能够抑制星状细胞I型胶原-RNA表达水平有关[6，7]，还有学者的实验结果[8]认为，黄芪抑制肝组织ICAM-1的表达，从而抑制肝纤维化时的免疫反应可能是其抗肝纤维化的重要机制之一。有学者[9]用黄芪注射液对30例慢性乙型肝炎患者做了30天1个疗程的治疗，结果表明黄芪具有明显抗纤维化的作用，并根据患者血清中转化生长因子β1及干扰素浓度的变化，认为黄芪抗肝纤维化的作用可能与其调节免疫，改变细胞因子活性有关。

笔者的实验资料表明，实验6周末时，黄芪对SD大鼠的体重、肝功能、肝细胞病变程度和肝纤维化程度等均有一定的保护作用。此时，3组大鼠的体重基本相似；尽管B、C两组大鼠的ALT、AST、A、TBA均有明显恶化，但C组大鼠的要比B组轻；肝细胞病变程度与肝纤维化程度的变化与肝功能变化规律大致类似。实验12周末时，除C组大鼠的生存率高于B组和体重高于B组外，两组大鼠的其他指标均出现相似的明显恶化。其中，B、C两组大鼠均出现腹水，腹水量无明显差异；肝脏病理改变均为G3S3～G3S4；ALT、AST、TBA值和肝脏胶原面积均明显高于A组。

上述实验结果提示，在损害因素持续存在的情况下，推荐剂量（1g/d）下的黄芪，对大鼠的营养状况（如体重）、肝功能、肝脏损伤、肝纤维化和肝硬化只有较短期的保护作用，如不去除有害因素，则无论是否应用黄芪，均不能阻止肝硬化和腹水的最终形成。

本文的结果与其他学者的不一致。其他学者均使用Wistar大鼠作为实验对象，而笔者使用的是SD大鼠，这是否是造成差别的原因尚不得而知。如果是这样的话，那么，将动物实验的结果去解释人体肝脏疾病过程则需谨慎对待。总之，有必要对黄芪在肝脏纤维化和肝硬化防治中的作用作进一步研究。

【参考文献】

1 马学惠.肝纤维化动物模型的造模方法.中华肝脏病杂志，1996，4（1）：58-60.

2 Ala-Kokko L, Günzler V, Hoek JB，et al. Hepatic fibrosis in rats produced by carbon tetrachloride and dimethylnitrosamine: observations suggesting immunoassays of serum for the 7S fragment of type.Collagen are a more sensitive index of liver damage than immunoassays for the NH2-terminal propeptide of type.Procollagen. Hepatology，1992，16(1)：167-172.

3 Vicente A, Jordi C. Ascites and hepatorenal syndrome in cirrhosis: pathophysiological basis of therapy and current management. J Hepatol，2003，38(suppl 1)：69-89.

4 朱春晓,顾勇,陈靖,等.肝硬化大鼠肾脏水通道蛋白2和血管加压素V2受体的表达及黄芪对其的作用.中华肾脏病杂志，2002，18(1)：45-48.

5 马红,王宝恩,陈翌阳,等.黄芪对肝纤维化治疗作用的实验研究.中华肝脏病杂志，1997，5（1）：32-33.

6 马雪梅,阴宏,马红,等.黄芪对HSC-T6 Col-I、TIMP1mRNA影响表达的研究.中医药学刊，2002，20（1）：99-100.

7 马红,王宝恩,马雪梅.黄芪抑制大鼠肝星状细胞增殖及胶原分泌的研究.中国中医药信息杂志，2001，8（4）：35-36.

8 王要军,权启镇,孙自勤,等.黄芪对实验性肝纤维化组织ICAM-1表达影响的免疫组化研究.中国临床药理学和治疗学，2000，5（1）：49-51.

9 程鹏,刘素侠,孙晋浩,等.黄芪抗肝纤维化的作用与转化生长因子β1和干扰素γ的关系.临床军医杂志，2000，28（3）：22-23.

作者单位：澳门，澳门镜湖医院消化科 上海，复旦大学附属华山医院消化科