Y-27632对家兔心肌缺血/再灌注损伤的有益作用

【摘要】目的 研究Rho激酶抑制剂Y-27632对家兔心肌缺血/再灌注损伤（IRI）是否有心脏保护作用。方法 健康家兔18只，体重2.0～2.5 kg，随机分为3组：IRI组、Y-27632（Y）组和假手术（C）组。用结扎左冠状动脉前降支60 min后剪断结扎线恢复血流30 min的方法建立在体心肌IRI模型，Y组于再灌注前5 min，经耳缘静脉注射Y-27632 0.35 mg/kg。检测左心室收缩功能，血浆肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）及心肌缺血、梗死范围。结果 IRI组缺血/再灌注导致左心室舒缩功能受损，左心室收缩峰压（LVSP）、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）下降，左心室舒张末期压力（LVEDP）升高，CK、LDH的释放增加，心肌梗死范围为（5.3±0.7）%；Y组在再灌注早期LVSP、±dp/dtmax下降的幅度和LVEDP升高的幅度、CK和LDH的释放，均明显低于IRI组，组间比较P均<0.05。心肌缺血、梗死范围也明显较IRI组小（缺血：40.5% υs 51.3%，P<0.05；梗死：1.7% υs 5.3%，P<0.01）。结论 Y-27632对家兔心肌IRI有部分心脏保护作用。

【关键词】缺血/再灌注损伤；Rho激酶；心脏；家兔

Effects of Y-27632 on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbits

LIANG Hong-ying，ZHENG Hui-zhen，WU Chun-ying，et al.Department of Physiology，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China

[Abstract]Objective To observe the effects of a Rho kinase inhibitor，Y-27632，on ischemia-reperfusion injury (IRI) in rabbit heart in vivo.Methods Eighteen rabbits were randomly divided into three groups: ischemia reperfusion (IRI) group，ischemia reperfusion plus Y-27632 (Y) group and sham operation (C) group.The animals were subjected to 60 min of left anterior descending coronary artery occlusion and 30 min reperfusion in IRI group.They were treated with Y-27632 at 350 μg/kg by intravenous injection 5 min before reperfusion in Y group.Results Ischemia-reperfusion led to myocardial infarction，the leakage of creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) and cardio function decrease.Y-27632 reduced ischemia reperfusion-induced myocardial infarction (1.7% υs 5.3%，P<0.01，compared with IR group).It also reduced ischemia reperfusion-induced the leakage of CK and LDH (28.9% υs 34.9% and 45.7% υs 79%，respectively P<0.05).Moreover，Y-27632 enhanced post-reperfusion myocardial systaltic function，left ventricular systolic pressure(LVSP)，the maximal rate of left ventricular pressure rise(+dp/dtmax) and left ventricular end-diastolic pressure(LVEDP) were significantly improved in Y-27632 group as compared with IRI group.Conclusion These results suggest that Y-27632 exerts partially cardioprotective effects during reperfusion，and that inhibition of Rho kinase may be a novel therapeutic trager to the treatment of acute myocardial ischemia-reperfusion injury.

[Key words]ischemia-reperfusion injury;Rho kinase;heart;rabbit

心肌缺血/再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是临床上缺血性心脏病治疗中亟待解决的关键问题之一。日益增多的研究资料查明，小G蛋白家族中的RhoA/Rho激酶信号通路参与多种心血管疾病的发病过程[1]，Rho激酶可能是多种心血管疾病的治疗靶点[2]，心[3]、肝[4]、肾[5]IRI的发病机制均涉及RhoA/Rho激酶信号系统。但是，Rho激酶是否为心脏IRI的治疗靶点，Rho激酶抑制剂是否可用于心肌IRI的防治？仍有待进一步研究。本文用家兔在体IRI实验模型，研究Rho激酶特异抑制剂Y-27632对IRI的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康家兔18只，体重2.0～2.5 kg，雌、雄兼有，由广东医学院实验动物中心提供。Y-27632（Calbiochem，德国），红四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）、伊文斯蓝（Evans Blue，Sigma）。MedLab生物信号采集处理系统（V5.5，南京美易科技有限公司）；动物人工呼吸机（浙江医科大学医学仪器实验厂）；全自动生化分析仪（SYNCHRONLX20，Beckman-Coulter公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与模型复制 家兔随机分为3组：（1）IRI组，n=6；（2）Y-27632（Y）组，n=6；（3）假手术（C）组，n=6。

用质量分数为3 g/L戊巴比妥钠（30 mg/kg）经家兔耳缘静脉注射麻醉，仰卧固定，行气管插管。四肢皮下插入针形引导电极，电极的另一端连接MedLab生物信号采集处理系统第3通道，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。沿家兔胸骨左缘切断第三、四肋，打开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏。IRI组在左冠状动脉前降支距房室沟约0.3 mm处穿线，于穿线处置一有凹槽的塑料软管，将塑料软管凹面朝上与左冠状动脉前降支一并结扎，以心电图出现明显S-T段抬高为结扎成功，维持缺血60 min，剪断结扎线，恢复血流灌注30 min。Y组于再灌注前5 min经耳缘静脉注射Y-27632（0.35 mg/kg），C组左冠状动脉前降支穿线后不结扎，观察90 min，余同IRI组。

1.2.2 左心室收缩功能检测 一直径约0.4 cm的心导管经右颈总动脉缓慢插入左心室，导管的另一端经压力换能器连接MedLab生物信号采集处理系统第1通道，采用室内压模块，设置参数为放大倍数：×200，滤波：全通10 kHz，采样间隔：10 ms，整个实验过程中连续记录左心室内压变化曲线。测量缺血前、缺血60 min、再灌注即刻、5、10、15、20、25、30 min等时间点的左心室收缩峰压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒张末期压力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室内压最大上升速率（the maximal rate of left ventricular pressure rise，+dp/dtmax）平均值。

1.2.3 心肌缺血、梗死范围测量 实验结束时再次结扎冠状动脉，从左心室导管内推注2%伊文斯蓝液3 ml，摘取心脏，以磷酸盐缓冲液冲洗，剪去心房及右心室组织，分离缺血区（无蓝色）与非缺血区（蓝色），滤纸吸干，分别称重。缺血组织切片，厚约3 mm，置于1% TTC磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中，37 ℃水浴15 min，将坏死区（灰白色）与非坏死区（深红色）分离，滤纸吸干分别称重。分别计算缺血区、坏死区及左心室重量，梗死范围以及坏死心肌占左心室重量与缺血区重量的百分比。

1.2.4 血浆肌酸激酶、乳酸脱氢酶检测 分别于缺血前、缺血60 min、再灌注30 min三个时间点从股动脉取血1.5 ml，离心20 min，3000 r/min，取血浆，用全自动生化分析仪及Beckman-Coulter公司试剂检测血浆乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）及肌酸激酶（creatine kinase，CK）。

1.3 统计学方法 实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 10.0统计软件包进行t检验或F检验，多组组间比较用LSD法或Dunnett’s法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌梗死范围的改变 C组未见心肌缺血、梗死现象。IRI组出现明显的心肌缺血、梗死，Y组也出现心肌缺血、梗死，但其缺血和梗死范围明显较IRI组小，组间比较P<0.05或P<0.01，见表1。表1 Y-27632对家兔心肌IRI诱导的心肌缺血、梗死范围的影响 注：与IRI组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 LDH和CK的变化 C组血浆LDH和CK活性在整个实验过程中基本稳定。缺血60 min时IRI组和Y组LDH、CK均明显升高，与缺血前比较P<0.05或P<0.01；再灌注30 min时，LDH、CK进一步升高，但Y组升高的幅度远不及IRI组，LDH变化值组间比较P<0.05，见表2。表2 Y-27632对家兔心脏IRI诱导的血浆LDH、CK的影响注：与缺血前比较，*P<0.05，**P<0.01；与IR组比较，P<0.05

2.3 左心室收缩功能的改变 C组在整个实验过程中，心功能各项指标基本稳定。IRI组和Y组心肌缺血后LVSP、+dp/dtmax均下降，而LVEDP则上升，再灌注后上述现象进一步加重，但Y组加重程度不及IRI组，在再灌注5、10、15、20 min等时间点，LVSP、+dp/dtmax的降低值，Y组均明显低于IRI组，组间比较均P<0.05；LVEDP的升高值在再灌注后20、25 min等时间点，Y组明显小于IRI组，组间比较均P<0.05或P<0.01，见表3。表3 Y-27632对家兔心脏IRI诱导的左室收缩功能改变的影响 注：与缺血前比较，*P<0.05，**P<0.01；与缺血60 min比较，#P<0.05，##P<0.01；与IR组比较，P<0.05

3 讨论

Y-27632是一种人工合成的吡啶类化合物[6，7]，(R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide，dihydrochloride；ROCK抑制剂，以载体介导的易化扩散方式被细胞摄取，在细胞内结合到小G蛋白Rho下游效应器Rho激酶的催化位点而抑制Rho激酶活性，其作用可被三磷酸腺苷（ATP）逆转。Y-27632对Rho激酶的两种亚型p160 Rock（ROCK-Ⅰ）和Roka（ROCK-Ⅱ）均有很强的亲和力和抑制作用。

LDH、CK正常情况下存在于细胞内，细胞膜破损后释放入血。一般认为，LDH、CK的释放与组织学上的心肌梗死范围相平行，可作为心肌细胞膜损伤的间接指标。本研究观察到，心肌缺血-再灌注后，血浆中LDH、CK大量增加，同时左心室5.3%的心肌梗死，再灌注前静脉注射Y-27632，可明显降低血浆LDH、CK水平，缩小心肌梗死范围，提示Y-27632能够对抗缺血-再灌注造成的心肌细胞损害，能够稳定细胞膜，减少细胞内酶的释放，减轻心肌细胞死亡。目前认为，心肌缺血-再灌注时，细胞膜受损甚至细胞死亡是由于再灌注时心肌组织氧自由基生成增多，增多的自由基与细胞内多价不饱和脂肪酸作用使之过氧化，造成细胞膜的正常结构破坏；膜蛋白功能抑制，促进自由基及其他生物活性物质生成，减少ATP生成等，从而导致细胞结构损伤和功能代谢障碍。我室的另一部分结果表明，另一种Rho激酶抑制剂法舒地尔减轻心肌IRI引起的细胞内钙超载和中性白细胞激活，Y-27632可能通过相同途径对心肌细胞的结构和功能代谢起保护作用，其详细机制有待进一步研究。

本研究也观察到，心肌IRI导致心肌舒缩功能降低，再灌注前给予Y-27632则明显改善再灌注早期的左室功能进一步降低，LVSP下降幅度和+dp/dtmax减慢的程度均明显低于未给药的IRI组，LVEDP升高的程度也低于IRI组，这些结果提示，Y-27632对再灌注引起的心肌收缩、舒张功能损害均有一定的改善作用，此作用主要发生在再灌注早期，是否与药物的剂量、维持时间有关，有待进一步研究。Y-27632对IRI导致的左心室心功能降低的有益作用可能是其抗再灌注造成的心肌细胞结构损害、心肌梗死作用的直接效应。由于Y-27632缩小心肌梗死范围，减轻心肌细胞损伤，因而心肌的收缩舒张功能得到改善。

综上所述，本研究结果表明，Rho激酶参与心脏IRI的发病机制，Rho激酶抑制剂Y-27632对心肌IRI有部分心脏保护作用。

（致谢：广东医学院第一临床学院2002级在读本科学生倪志玲、吴国志、潘丽萍、 张明伟等参加了部分实验工作，特此致谢）

【参考文献】

1 Shimokawa H，Takeshita A.Rho-kinase is an important therapeutic target in cardiovas medicine.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25: 1767-1775.

2 Lai A，Frishman WH.Rho-kinase inhibition in the therapy of cardiovascular disease.Cardiol Rev，2005，13:285-292.

3 Bao W，Hu E，Tao L.Inhibition of Rho-kinase protects the heart against ischemia/reperfusion injury.Cardiovasc Res，2004，61: 548-558.

4 Kawaguchi A，Ohmori M，Fujimura A.Partial protective effect of Y-27632，a Rho kinase inhibitor，against hepatic ischemia-reperfusion injury in rats.Eur J Pharmacol.2004，493:167-171.

5 Teraishi K，Kurata H，Nakajima A，et al.Preventive effect of Y-27632，a selective Rho-kinase inhibitor，on ischemia/reperfusion-induced acute renal failure in rats.Eur J Pharmacol，2004，505: 205-211.

6 Narumiya S，Ishizaki T，Uehata M.Use and properties of ROCK-specific inhibitor Y-27632.Methods Enzymol，2000，325:273-284.

7 Ishizaki T，Uehata M，Tamechika I，et al.Phamacological propertics of Y-27632，a specific inhibitor of Rho-associated kinase.Mol Pharmacol，2000，57:976-983.

作者单位：524023 广东湛江，广东医学院生理科学实验室（生理研究室，通讯作者，第一临床学院）