VEGF 936C/T基因多态性与进展性卒中相关性的研究

【摘要】目的 探讨VEGF936C/T多态性与进展性卒中的相关性。方法 经临床确诊的脑梗死患者200例，分成普通脑梗死组134例和进展性卒中组66例，另选年龄、性别相匹配的健康对照组100例。应用RFLP方法对所有受检者的VEGF基因型进行鉴定；分析VEGF936C/T基因多态性与进展性卒中的相关性。结果 进展性卒中组936T等位基因的携带频率高于健康对照组，VEGF936T与进展性卒中有相关性（OR：1.882；95%可信区间1.269～2.789）；而普通脑梗死组936T等位基因的携带频率与健康对照组差异无统计学意义。结论 携带936T等位基因可增加患者脑梗死进展的风险性，而936CC可降低脑梗死进展的风险性。

【关键词】进展性卒中 VEGF936C/T 单核苷酸多态性

Correlative study on 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and advancing stroke

LI Qiao-zhuan,JIN Yong-hua.Neurology Department,the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Heilongjiang 150086,China

[Abstract]Objective To investigate the association between 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor（VEGF）and stroke in progression risk.Methods Using the method of restrictive fragment length polymorphism（RFLP）,the VEGF genotypes of 66 stroke in progression patients,134 completed stroke patients and 100 healthy control subjects were detected.The association between VEGF 936C/T gene polymorphism and stroke in progression was compared.Results The frequency of VEGF carreiers with 936T-allele（936CT+936TT）in progression stroke patients was significantly higher than that in control group,while the frequency of VEGF 936T allele in completed stroke was similar with that in control group.There was positive association between VEGF 936T and stroke in progression（OR 1.882;95% CI 1.269～2.789）.Conclusion VEGF 936T-allele can raise the risk of stoke evolution while VEGF 936CC can decrease the risk of stroke in progression.

[Key words]advancing stroke;VEGF 936C/T;single nucleotide polymorphisms

进展性卒中（stroke in progression,SIP）是指卒中发病后神经功能缺失症状在48 h内逐渐进展或呈阶梯式加重。其发病率为卒中患者的30%，致残率和致死率较一般卒中高，是影响病人预后的重要原因之一，也是脑血管病治疗中的难点。目前，已经发现的危险因素有高血压病、糖尿病、感染、人疱疹病毒感染和脑血管狭窄等。尽管我们对以上危险因素进行了积极的防治，仍有一部分患者会进展。说明进展性卒中的病因仍没有完全阐明。遗传、多基因、多态性这三个方面是进展性卒中研究的热点。应用单核苷酸多态性进行遗传性相关性研究，可以为脑卒中进展的危险性提供预示作用。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）因其可以增加血管通透性，诱导血管新生，促进缺血部位侧支循环的建立，使其成为目前缺血性疾病研究的热点之一。脑血管内皮细胞的凋亡和缺血半暗带细胞的坏死是进展性卒中的发病机制。然而，发生在VEGF基因3’端非转录区936位点的常见突变，即C-T易位，其中，VEGF936T据报道与VEGF的低血浆水平显著相关[1]。国内外有研究证实，VEGF936T与乳腺癌[2]、糖尿病肾病等的发生密切相关。基于上述，我们推测VEGF936C/T多态性与进展性卒中相关。现探讨VEGF 936T与进展性卒中的相关性如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2005年1月～2006年1月期间哈尔滨医科大学附属二院神经内科病房的住院患者200例，男107例，女93例，年龄35～75岁，平均（62±10.3）岁，排除其他肿瘤性疾病。按病变进展情况分为普通脑梗死组134例和进展性卒中组66例。对所有患者标明有无进展性卒中可能的危险因素[3]（糖尿病、高血压病、感染、脑血管狭窄>50%、高血脂、高尿酸、高纤维蛋白原），同时选取与病例组的性别和年龄相匹配的健康志愿者100例作为对照组。所有研究对象均为东北汉族人。

1.2 仪器与试剂 人血基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）由TIANGEN-QIAGEN提供；Taq酶、dNTP、10×loading buffer、20bp DNA marker购自Takara公司；NIaⅢ限制性内切酶购自NEB；VEGF引物合成由美国ABI公司完成。

1.3 方法 用RFLP法鉴定VEGF的基因型。抽取每位受检者空腹静脉血3ml,按照常规方法从白细胞中提取基因组DNA，4 ℃保存。PCR引物参照文献[2]设计并合成，正向引物：5’-AAGGAAGA GGAGACTCTGCGC-3’，反向引物：5’-TATGTGGGTGGGTGTGTCTA CAG-3’。PCR反应体系50 μl,包括正向反向引物各1 μl、dNTP4 μl、模板DNA 8 μl、Taq酶1 μl、ddH2O 30 μl、lodding buffer 5 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性4min、95 ℃变性30s、60 ℃退火45s、72 ℃延伸45s、30个循环后、72 ℃再延伸5min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，为198bp。PCR产物用限制性内切酶NIaⅢ（New England Biolabs）5 u于37 ℃消化3 h后，再经4%琼脂糖凝胶电泳鉴定VEGF基因型。

1.4 统计学方法 所有数据应用windows SPSS 13.0统计软件进行分析。Hardy-Weinberg平衡和计数资料用 χ2检验；通过Logistic回归筛选进展性卒中的危险因素，优势比（odds ratio,OR）用来衡量卒中进展的风险性。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

用RFLP法鉴定VEGF的基因型，其电泳结果见图1。VEGF 936C不被分解（198bp）,而VEGF936T被分解为两段（分别为114bp和84bp）。糖尿病、高血压病、感染、脑血管狭窄和VEGF936T携带者均是进展性卒中的危险因素。病例组和对照组的基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，进展性卒中组与普通脑梗死组基因型分布情况比较见表1；进展性卒中组与健康对照组基因型分布情况比较见表2；普通脑梗死组与健康对照组基因型分布情况比较见表3。说明进展性卒中组和普通脑梗死组的VEGF936 C/T基因型分布不同，不能认为普通脑梗死组和健康对照组的VEGF936C/T基因型分布相同。进展性卒中组VEGF936T等位基因携带者的频率为50%，显著高于普通脑梗死组的31.3%，进展性卒中的936T等位基因携带者的比值比OR值为1.882，95%的可信区间为1.269～2.789,见表4。说明VEGF936T等位基因携带者与VEGF936CC纯合子的患者相比卒中进展的风险性会增高1.882倍。表1 进展性卒中组和普通脑梗死组VEGF936基因型分布的比较 表2 进展性卒中组和健康对照组VEGF936基因型分布的比较表3 普通脑梗死组和健康对照组VEGF936 基因型分布的比较表4 进展性卒中VEGF936T有关参数的估计值

3 讨论

通过对VEGF 3’端非转录区936位点基因多态性在进展性卒中组、普通脑梗死组和健康对照组中的比较，我们发现，936C/T突变减少了VEGF的表达，VEGF936T与进展性卒中相关。该结果显示，VEGF基因多态性，至少在东北汉族人中，是进展性卒中的主要遗传危险因子；然而，我们不能排除VEGF基因的其他一些至今未知的突变，以及另外一些基因的突变在进展性卒中的易感性危险因素中起一定作用。

VEGF可以增加血管通透性，诱导血管新生，同时，VEGF作为局部内生性调节剂，能够保持内皮细胞的完整性，维持内皮细胞的正常功能，从而避免触发内源性或外源性凝血途径[4]。研究发现VEGF还能够增加丝氨酸蛋白酶、纤维蛋白溶解酶、尿激酶和组织型纤溶酶原的表达和活性，从而发挥抗血栓形成作用[5]。目前国外有文献报道，VEGF对缺血脑细胞DNA损害与修复具有重要影响[6]，另有文献报道，VEGF可诱导抗凋亡蛋白的表达，是内皮细胞的一个生存因素。如果VEGF的量低于阈值，脑血管内皮细胞将因为VEGF依赖的内皮细胞生存过程的缩短而程序性死亡[7]。因此VEGF可以通过阻止血栓进展、溶解已形成的血栓，建立侧支循环、减缓细胞凋亡等方面来防止卒中的进展。

脑梗死时，缺氧可导致进行性的毛细血管内皮细胞和上皮细胞的丢失以及细胞外基质和神经元的坏死，这些细胞的坏死是通过凋亡发生的。在脑卒中的发生发展中，多种潜在的遗传危险因素可能参与其发病机制。在进展性卒中中，可能有VEGF的表达不足和经VEGF受体2的信号传达的缺陷，源于内皮细胞受体数量的下降，或者VEGF受体/蛋白激酶活性的缺陷。影响VEGF分泌的因素有很多，VEGF936T据报道与血管内皮生长因子的低血浆水平显著相关。缺氧可诱导内皮细胞的凋亡，加速半暗带细胞的不可逆的坏死，而缺氧诱导的VEGF的表达的增高可延缓内皮细胞的凋亡，促进侧支循环的形成，促进脑梗死的恢复，当缺氧对脑组织的损害作用与其诱导的VEGF高表达对脑组织的保护作用失衡时，将会导致进展性卒中的形成。由此我们推测，VEGF936T携带者由于VEGF分泌的相对不足而导致了卒中的进展。

VEGF936T等位基因者血浆低VEGF水平的确切机制至今未知。对潜在的转录因子结合位点的分析表明：VEGF936C有一个潜在的AP-4[1]（activator protein 4）结合位点，而936T则没有，936位C-T突变导致了AP-4的潜在结合位点丢失。AP-4是一个螺旋环-螺旋转录因子。它通过结合于特殊的增强位点增强多种基因的转录。AP-4的潜在结合位点被VEGF936C-T突变破坏也许可以解释该突变同VEGF的低血浆水平的相关性。另一个可能的解释是该突变同VEGF基因序列其他部位未知突变之间的连锁性失衡。

影响VEGF分泌的因素有很多，将来各种刺激因素所诱发的VEGF的表达，与特殊基因型之间的相互关系将引发对VEGF介导的进展性卒中的个体易感性的鉴别。对疾病相关性的研究也许会揭示发生在VEGF基因序列其他位置的未知的功能性突变同进展性卒中患者之间的关联性。

【参考文献】

1 Renner W,Koschan S,Hoffman C,et al.A common 936C/T mutation in the gene of vascular endothelial growth factor is associated with vascular endothelial growth factor plasma levels.J Vasc Res,2000,37:443-448.

2 Krippl P,Langsenlehner U,Renner W,et al.A common 936C/T gene polymorphism of vascular endothelial growth factor is associated with decreaced breast cancer risk.Int J Cancer,2003,106:468-471.

3 贺维亚，黄晓哲，蒋建华.进展性卒中相关危险因素的临床分析.中风与神经疾病杂志，2004，21（5）:461-462.

4 Couffin T,Kearney M,Witzenbichler B,et al.Vascular endothelial growth factor /vascular permeability factor in normal and atherosclerotic human arteries.Am Pathol,1997,150（5）:1673-1685.

5 Pepper MS,Ferrara N,Oci L,et al.Vascular endothelial growth factor induces plasmminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 in microvascular endothelial cells.Biochem Biophys Res Commun,1991,181（2）:902-906.

6 Yang ZJ,Bao WL,Qiu MH,et al.Role of vascular endothelial growth factor in neuronal DNA damage and repair in rat brain following a trasicent cerebral ischemia.J Neurosci Rev,2002,70（2）:140-149.

7 Alon T,Hemo I,Itin A,et al.Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vassels and has implication for fretiopathy of prematrurity.Nat Med,1995,1（10）:1024-1028.

作者单位：150086 黑龙江哈尔滨，哈尔滨医科大学附属二院神经内科