卡维地洛瞬时效应对兔肥厚左心室跨壁复极离散度及心律失常影响

【摘要】目的 探讨血药浓度下卡维地洛瞬时效应对于兔肥厚左心室跨壁复极离散度及心律失常的影响。方法 采用腹主动脉缩窄法制做左心室肥厚兔模型，术后持续予以卡维地洛1 mg/kg，2次/d，共10周。高效液相色谱分析法测定稳定期血药浓度；对比台式液、血药浓度的卡维地洛台式液灌注下同一肥厚左室心肌组织块动作电位、跨壁复极离散度、QT间期及心律失常发生率。结果（1）稳定期血药浓度为0.1 μmol/L。（2）该浓度的卡维地洛台式液灌注对肥厚大室心肌动作电位、跨壁复极离散度、QT间期及心律失常发生率无显著影响。结论 常规剂量下，卡维地洛改善左室肥厚预后的作用与其瞬时效应无关。

【关键词】卡维地洛；瞬时效应；左心室肥厚；跨壁复极离散度

Transient function of carvedilol on transmural dispersion of repolarization and arrhythmia of rabbit hypertrophic left ventricles

YAO Qing-hai,CUI Chang-cong,WU Shang-qin,et al.Department of Cardiology,The First Hospital of Xi’an Jiaotong University,Shanxi 710061,China

[Abstract]Objective To study the transient function of Carvedilol（CVD）at the concentration of serum level on transmural dispersion of repolarization（TDR）and arrhythmia of rabbit hypertrophic left ventricles（LVH）.Methods LVH rabbits were created with partially abdominal aortia-ligating.These models were administered with CVD at the dose of 1 mg/kg,twice a day,after operation for 10 weeks.The stable serum concentrations of CVD were analyzed with HPLC.The hypertrophic left ventricular wedge preparations were perfused with Tyrode solution and CVD plus Tyrode successively for 1 hour.APD were recorded in endocardium,epicardium of LVH preparation,TDR,QT intervals and ratio of arrhythmia were compared at the different perfusion.Results（1）The stable serum concentration of CVD was 0.1 μmol/L;（2）There was no significant difference of APD,TDR,QT intervals and ratio of arrhythmia perfused with both Tyrode and CVD plus Tyrode solution.Conclusion The effects of CVD on the improvement to electrical remodeling of left ventricles are not related to its transient function.

[Key words]carvedilol;transient function;left ventricular hypertrophy;transmural dispersion of repolarization

心性猝死（sudden cardiac death，SCD）是心室肥厚及早期心力衰竭患者的主要死因[1,2]。卡维地洛（carvedilol，CVD）是第三代β受体阻滞剂的代表，COPERNICUS[3]、COMET[4]等临床循证医学试验证实CVD能显著降低上述患者预后，有关CVD上述效应确切机制的探讨已成为心脏学界热点之一。国内外研究[5，6]显示：跨壁复极离散度（transmural dispersion of repolarization,TDR）显著增大基础上的跨室壁折返是引起多形性室速（polymorphic ventricular tachycardia，PMVT）、尖端扭转性室速（torsade de pointes，Tdp），进而导致SCD的主要机制。本组先前研究[7]显示：CVD长期干预能显著降低TDR和室性心律失常率。但单细胞研究表明[8]：不同浓度的CVD能够直接影响心肌细胞的跨膜离子流强度，进而改变心肌细胞复极过程以及动作电位特征，这种效应具有瞬时性、浓度依赖性。该效应是否与CVD预防SCD效果相关尚无报道。本研究以CVD长期灌胃的稳定期血药浓度为基准，探讨CVD瞬时效应对于兔肥厚左心室跨壁复极离散度及心律失常的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 选择10~12周龄健康大白兔，体重1 900~2 100 kg，由西安交通大学动物实验中心提供。

1.1.2 仪器 多普勒超声心动仪（HP Sonos 2500，USA）；DT-100型电子天平；MEZ-8301型、MEZ-7101型微电极放大器、SEN-7103型电刺激仪、SS-102J型刺激隔离器、VC-11双线记忆示波器；手动微电极操纵器（带千分微调尺）3台；自制有机玻璃恒温灌流肌浴槽；CS501型超级恒温器；LDB-H型电子蠕动泵；玻璃微电极毛胚；PB-2型微电极拉制仪；PowerLab/8sp实验数据记录分析系统。

1.1.3 试剂 3%戊巴比妥钠；台氏液（Tyrode’s solution）构成：NaCl 129.0 mmol/L,KCl 4.0 mmol/L,NaH2PO4 0.9 mmol/L,NaHCO3 20.0 mmol/L,CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4 0.5 mmol/L,葡萄糖5.5 mmol/L,胰岛素1 u/L；心脏停搏液：KCl浓度为24 mmol/L的台氏液。卡维地洛标准品由上海罗氏药业集团提供。甲醇：色谱纯，批号980711，天津市康科德科技有限公司生产；乙腈：购自上海勤工化学厂。

1.2 方法

1.2.1 左心室肥厚兔模型的制备及CVD灌胃 采用肾上腹主动脉部分结扎法制做兔左心室高后负荷模型[9]。腹主动脉结扎术后48 h，开始对兔进行CVD 1 mg/kg，每日2次灌胃，共持续10周。

1.2.2 CVD灌胃动物稳定期血药浓度测定 采用高效液相色谱分析法；以最后一次给药后3～6 h内的CVD血药浓度为稳定期血药浓度。具体步骤：（1）耳缘静脉采血4 ml，注入枸橼酸钠抗凝管中。4 ℃条件下，4000 r/min离心10 min，吸取上清液-20 ℃冻存。（2）标准空白血清制备：取正常成年兔全血100 ml，在4 ℃条件下，经低温高速离心后取血清部分冻存。（3）血样处理：将1 ml血样加入0.1 ml 0.1N的NaOH溶液中，再加入0.9 ml饱和NaCl溶液。用5 ml乙醚萃取。于-30 ℃冷冻后，倒出上层的有机相，加入250 μl磷酸盐溶液（50 mmol,pH 2.0）进行反萃。取50 μl水层进样。（4）标准曲线制作：在标准空白血清内加入CVD标准品，配制成浓度为25、50、100、250、500、1000、2000 ng/ml的一系列血清样品。按照样品处理法处理后进行测定。根据测定结果拟合加权回归方程，检测波长240 nm。（5）精密度检测和回收率试验：精密度检测采用日内变异；取空白血清，加入定量的CVD标准品，配制50、250、1000 ng/ml浓度的卡维地洛溶液，在（285±1）nm处测定吸收度，计算回收率。（6）样品浓度测定：将1 ml待测血清加入0.1 ml 0.1N的NaOH溶液中，再加入0.9 ml饱和NaCl溶液。用5 ml乙醚萃取。于-30 ℃冷冻后，倒出上层的有机相，加入250 μl磷酸盐溶液（50 mmol，pH 2.0）进行反萃。精密测量水层样50 μl注入色谱仪，记录色谱图，量取峰值面积。以稳定期CVD浓度（HPLC法测定）为基准，在DMSO助溶下，配制含等浓度CVD的台式液。记录普通台式液、CVD台式液灌注（各持续1 h）对肥厚心肌标本动作电位和TDR的影响。

1.2.3 经冠状小动脉灌注的兔左心室楔形组织块的制作和灌流 参照文献[10]。肝素抗凝及戊巴比妥钠充分麻醉基础上，迅速开胸取出心脏放入4 ℃高钾台氏液中，使心脏停搏。以自制冠脉灌注管经左冠状动脉开口插入冠状动脉左室支，予以台氏液灌注，并结扎固定冠脉灌注管。分离出以冠脉血管为中心轴、长约10~20 mm、宽约5~10 mm厚约3~4 mm心室肌楔形组织块，在恒温肌浴槽内固定。将冠脉灌注管连接蠕动泵行持续台氏液灌流，保证灌注压维持在20~30 mm Hg。在浴槽内及灌流的台氏液中持续充混合气（95%O2与5%CO2），使pH值维持在7.35~7.45。温度恒定于37 ℃。将自制双极同心银电极固定于组织块的心内膜面，给予基础周长（basic cycle length，BCL）1 s的电刺激使组织块平衡1 h。保持心电图电极和心内、外膜浮置玻璃微电极置于同一跨壁轴线上。

1.2.4 对比指标 对比台式液、稳定期CVD血药浓度的台式液分别灌注1 h时肥厚左心室标本APD、TDR以及QT间期变化；对比台式液及CVD台式液灌注过程中心律失常发生率的变化。动作电位时程（APD）以90%复极时的动作电位时程（APD90）计算；同一部位内、外层心肌中APD差值（APDmax-APDmin）为跨壁复极离散度，本文以APD90离散度（APD90max-APD90min）作为TDR评价指标。

1.3 统计学方法 所有数值均采用（x±s）表示。采用SPSS 11.0软件进行分析，两组之间比较采用独立样本t检验，率比较采用χ2检验，P<0.05为差异具有显著性。表1 普通台式液及0.1 μmol/L CVD台式液灌注时APD、TDR及QT间期比较注：同一肥厚心肌标本在0.1 μmol/L CVD台式液与台式液灌注1 h的APD90、TDR及QT间期相比较，各指标之间差异无显著性（P>0.05）

2 结果

2.1 卡维地洛灌胃组兔稳定期血药浓度测定 测定来自10只卡维地洛灌胃组兔的血样标本，每只动物分离出3份，测定后取平均值。以上结果显示灌胃组兔血液中卡维地洛浓度为（0.106±0.035）μmol/L，本研究取0.1 μmol/L为稳定期血药浓度。

2.2 0.1 μmol/L CVD台式液灌注对于结扎组兔心肌标本APD、TDR的影响 在台式液、0.1 μmol/L CVD台式液灌注过程中，同一组肥厚左心室标本APD90和TDR的无显著变化；室性心律失常发生率无显著变化（P>0.05）。

2.3 0.1 μmol/L CVD台式液灌注对于结扎组标本室性心律失常的影响 台式液灌注过程中，8/9例出现2或3相EAD，7/9例触发R-on-T早搏，5/9例出现自发性PMVT或Tdp，三者发生率分别为88.9%、77.8%、55.6%；0.1 μmol/L CVD台式液灌注过程中，8/9例发生EAD，7/9例出现R-on-T早搏，6/9例触发PMVT或Tdp，三者发生率分别为88.9%、77.8%、66.7%。两组标本的室性心律失常发生率之间差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

与其他β1受体阻滞剂不同，CVD能通过长期效应和瞬时效应两种方式影响心室肌细胞的电生理特性，长期效应指长期给药对于心脏电重塑的改善，是神经内分泌拮抗、减轻心脏负荷、降低心肌耗氧、抗氧化应激等的综合体现。瞬时效应指CVD能与多种心肌细胞离子通道的膜外位点瞬间形成低亲和力结合，发挥通道阻滞作用。不同浓度的CVD能够直接影响单个心肌细胞的多种跨膜离子流强度，包括复极相关电流Ikr、Ito、Ica-L和Iks，半数抑制浓度IC50分别为0.35、3.34、3.59和12.54 μmol/L[8]。该效应具有以下特点：（1）靶通道具有多样性和非特异性；（2）靶通道的类型、特定跨膜离子流抑制程度均和CVD浓度密切相关，而膜电压无关；（3）离子通道阻滞效应发生迅速，如CVD组织HERG基因编码产物Ikr通道仅需2 min，起效远快于其特异性通道阻断剂Dofetilide[11]；（4）结合不紧密，能被灌流液部分洗脱。

在连续服用CVD的个体中，上述两种效应显然同时存在。明确CVD的瞬时效应对于肥厚左室心肌动作电位、跨壁复极离散度以及室性心律失常的影响，有利于加深对于CVD药理机制的全面、深入理解，且对于CVD用药方式具有重要指导意义。

CVD在口服给药1~2 h达到血浆峰药浓度，血浆清除半衰期2～8 h，体内排除半衰期7～10 h。我们将采血时间控制在灌胃给药后3～6 h，于血药浓度峰值之后和第一个半衰期到来之前，这时的血药浓度代表了整个干预过程中的稳定浓度值，经HPLC法测定近似于0.1 μmol/L。

与普通台式液相比，0.1 μmol/L CVD灌注下肥厚心室肌电生理模型内外膜动作电位、跨壁复极离散度及QT间期无显著差异；在相同灌注时间内，后除极、R-on-T室性早搏以及PMVT/Tdp的发生率差异不明显。结合长期干预试验[7]结果，笔者认为：CVD对离子流阻滞的瞬时效应对肥厚心室心律失常的发生并无影响，究其原因可能与稳定期血药浓度（0.1 μmol/L）显著低于其复极电流相关通道有效阻滞浓度（0.35~12.54 μmol/L）[8]有关；同时也表明CVD预防SCD、改善预后作用主要是通过其长期效应来实现的。因此对于左心室肥厚以及心力衰竭患者，尽早、长期、全程应用卡维地洛是改善预后的唯一途径。

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作者单位：710061 陕西西安，西安交通大学第一医院心内科