纳米羟基磷灰石体外诱导肝癌细胞死亡的研究

【摘要】 利用化学方法辅助超声制备出稳定单分散的纳米羟基磷灰石。应用原子力显微镜（AFM）、粒径电位仪对纳米羟基磷灰石进行表征；采用形态学观察和MTT比色法研究纳米HA对细胞系Bel-7402人肝癌细胞的作用；从超微结构及细胞周期的改变研究其作用机制。实验结果表明，纳米羟基磷灰石在体外对Bel-7402人肝癌细胞具有明显的抑制作用。通过进入到癌细胞内，阻滞细胞周期的进展，使细胞在G1期堆积，直接导致癌细胞死亡。

【关键词】 纳米羟基磷灰石；肝癌；毒性

Cytotoxinic mechanism of hydroxyapatide nanoparticles on human hepatoma cell lines

CAO Xian-ying，ZHANG Li-na，LI Shi-pu，et al.Biomedical Materials and Engineering Research Center，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China

【Abstract】 Stable and single-dispersed HAP nanoparticles were synthesized with chemical method assisted by ultrasonic treatment. HAP nanoparticles was surveyed by AFM and Zataplus. Effect was investigated on the Bel-7402 human hepatoma cell lines treated with HAP nanopartiles by the MTT methods and observation of morphology，and the mechanism was studied in changes of cell cycle and ultrastructure. The result showed that inhibition of HAP nanoparticles on the Bel-7402 human hepatoma cell lines was presented obviously in vitro. HAP nanoparticles entered cancer cytoplasm，and cells’ proliferation were stopped at G1 phase of cell cycle，Thus，cancer cells died directly.

【Key words】 hydroxyapatite; nanoparticles; hepatic cancer;Toxic

随着纳米科技的发展，纳米生物材料在医学上的研究和应用开始崭露头角。笔者研究发现，某些无机纳米粒子具有纳米生物学效应[1]-当这些无机纳米粒子小到纳米级时，既可阻止癌细胞的增殖，抑制癌细胞的生长，同时，对正常细胞影响较小。为了进一步证实无机纳米粒子的抑癌生物学特性，围绕纳米粒子与肿瘤细胞之间的相互作用进行了以下研究[2～8]：(1)纳米羟基磷灰石（HA）的粒径对癌细胞抑制作用的影响，结果显示，当纳米羟基磷灰石粒径大于80nm时，这种抑制作用就会消失。(2)纳米羟基磷灰石对不同肿瘤细胞系的作用，体外实验结果表明，纳米羟基磷灰石对人喉癌细胞系Help-2、人胃癌细胞系MGc80-3、人食管癌细胞系Ec-109、人骨肉瘤细胞系Os-732、人肝癌细胞系Bel-7402等10余种癌细胞系的增殖都有不同程度的抑制作用。(3)不同纳米粒子对癌细胞的作用，制备了羟基磷灰石、二氧化钛、二氧化硅及氮化硅等无机纳米粒子，通过MTT比色法检测，发现纳米羟基磷灰石的抑癌效果最好，高于其他纳米粒子。为了深入研究无机纳米粒子的抑癌作用，笔者选用纳米羟基磷灰石，以细胞系Bel-7402人肝癌细胞为作用对象，对其抑癌作用机制进行了研究。

1 材料与方法

1.1 纳米羟基磷灰石的制备 在200ml Ca(OH)2过饱和溶液中加入稳定剂，再将Ca(H2PO4)·H2O 溶液快速加入，磁力搅拌器强力搅拌，辅助超声30min左右，待反应完成后置于冷冻干燥器中冷冻，干燥，得到纳米羟基磷灰石。

用于细胞毒性、细胞周期和细胞超微结构检测的纳米羟基磷灰石，用蒸馏水配制成1.4 mmol/L，临用前常规高压灭菌，用RPMI-1640培养液稀释成所需浓度，备用。

1.2 原子力显微镜（AFM）观察 将纳米羟基磷灰石超声分散到蒸馏水中，取适量滴在云母片上，红外灯下烤干，行AFM（AP-990，USA）观察。

1.3 粒径及粒度分布检测 将上述方法制备的纳米羟基磷灰石超声分散到蒸馏水中，然后加入试样盒内，用电位粒度仪（3000HSA，MALVERN，Britain）测定其平均粒径和粒度分布。

1.4 细胞系及其培养 细胞系Bel-7402人肝癌细胞，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所，由武汉大学典型培养物保藏中心保存。用RPMI-1640培养液（Gibco），添加10%新生牛血清（Gibco）、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素，在37℃ 95%空气和5%CO2的条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.5 细胞毒性的测定 将细胞调整浓度为1×105/ml，接种于96孔培养板上，100μl/孔。培养24h后，加入不同浓度的纳米羟基磷灰石，置于培养箱中培养7天，每隔24h观察细胞的形态变化，同时按照噻唑蓝（MTT）法[9]测定细胞的存活情况，用吸光度（OD570nm）值表示，并计算细胞生长抑制率。实验重复3次。全部实验统计结果进行t检验。

抑制率（%）=（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%

1.6 细胞周期的检测 将1×104个细胞接种到培养瓶中，培养24h后，分别加入不同浓度的纳米羟基磷灰石，连续培养5天，分别于72h、96h、120h离心收集细胞，无Ca2+、Mg2+的PBS洗涤2次，振荡使细胞分散；70%冷乙醇4℃固定18h以上；上机测定前，离心去乙醇，用磷酸缓冲液洗3次，加入50μg/ml RNase 37℃消化30min，PI 50μg/ml，4℃避光染色30min以上；经尼龙网过滤后，用流式细胞仪（FACSort）测定细胞周期的分布，结果经计算机软件处理，计算出各周期时相的细胞百分比。实验重复3次。

1.7 细胞超微结构观察 收集纳米羟基磷灰石处理后的细胞，离心成团，加入3%戊二醛固定，0.1M PBS洗3次，每次10min；1%锇酸后固定，PBS洗10min；常规脱水，包埋剂包埋、聚合、修块，LKB-Ⅴ超薄切片；柠檬酸铅和醋酸双氧铀双重染色；在分析透射电镜下观察细胞超微结构的变化并摄片。

2 实验结果与讨论

2.1 纳米羟基磷灰石的形貌及粒度分布 AFM观察纳米羟基磷灰石呈球形(见图1)，粒径为20nm左右。由于使用超声波进行分散，纳米粒子分布比较均匀。粒度电位仪是应用激光散射的方法测试粒子平均粒径和粒度分布，检测结果显示二次粒子的平均大小，纳米羟基磷灰石的平均粒径为51.0nm，粒度分布只有一个狭窄的单峰（见图2），说明颗粒生长均匀，分散性良好，纳米粒子呈单分散状态。

2.2 纳米羟基磷灰石对Bel-7402细胞增殖及形态的影响

图1 AFM下纳米羟基磷灰石的立体形貌

图2 纳米HA的平均粒径和粒度分布

2.2.1 纳米羟基磷灰石对Bel-7402细胞增殖影响 表1显示0.07～0.70 mmol/L 范围内的纳米羟基磷灰石作用4天Bel-7402细胞增殖状态，≤0.14 mmol/L的纳米羟基磷灰石作用4天后存活率仍在90%以上，提示该浓度以下的纳米羟基磷灰石不会引起癌细胞的明显死亡，而浓度超过0.35 mmol/L以后，肝癌细胞的存活率明显下降。从图3可见，纳米羟基磷灰石随着作用时间的延长，其对肝癌细胞的抑制率也明显增加，有显著相关性（P<0.05)。体外使用较小剂量的纳米羟基磷灰石作用于Bel-7402细胞，也显示了良好的时效关系，这为临床上选用小剂量纳米羟基磷灰石长期使用提供了实验依据，从而避免短时间使用大剂量纳米羟基磷灰石所带来的不良反应。表1 纳米羟基磷灰石的细胞毒性注：与对照组相比*P<0.05，**P<0.01

2.2.2 纳米羟基磷灰石对Bel-7402细胞形态的影响 在正常培养状态下，Bel-7402细胞形态生长良好，表现为多边形。经纳米羟基磷灰石处理后，出现细胞变小、变圆，部分细胞脱落漂浮于培养基中。随着作用时间的延长，剂量的增大，其漂浮细胞也增多。

2.3 细胞周期分析 细胞周期的测定可以反映细胞的增殖和生长状况。FCM检测的Bel-7402细胞周期分布，见表2。细胞周期分析显示：正常状态下Bel-7402细胞系多数处于G1期，S期次之，G2/M期最少。0.56 mmol/L的纳米羟基磷灰石作用于Bel-7402细胞不同时间后，与对照组比较，G1期细胞明显增多，S期和G2/M期细胞相应减少，呈一定的时间效应关系。G1期是决定细胞增殖状态的关键阶段，存在调节细胞增殖周期的检测点（R点），它可以接受多种环境信号的调节，控制着细胞增殖活动的进程，是细胞增殖与否的转折点。R点可阻止受损伤的细胞进入S期，从而导致细胞增殖的抑制。表2 纳米羟基磷灰石对Bel-7402 细胞 周期时相的影响 注：与阴性对照组相比*P<0.05，**P<0.01

2.4 细胞超微结构变化 观察细胞超微结构的改变是目前确定细胞形态的最可靠方法之一。Bel-7402细胞在通常情况下表面具有丰富的微绒毛，胞核形态不规则，核膜显示齿状或深凹陷，染色质浓密；胞浆内线粒体、滑面及粗面内质网量少。纳米羟基磷灰石处理的肝癌细胞，部分出现胞质空泡，细胞胞核染色质浓缩、边集，线粒体及内质网数量极少，核膜间隙不等（见图4）。纳米羟基磷灰石由于高的表面能以及表面存在大量缺陷，可以通过吸附在癌细胞的表面，并进入到癌细胞内发挥作用。

图4 纳米羟基磷灰石作用72h后Bel-7402细胞超微结构

总之，体外纳米羟基磷灰石能有效地抑制肝癌细胞株增殖。这有益于开拓纳米羟基磷灰石的应用前景，且该药易得、价廉，因而深入研究其作用机制和体内抗癌的理想剂量，以求提高疗效，减少不良反应，无疑将有重大的临床意义。

3 结论

(1)纳米羟基磷灰石生长均匀，分散很好，纳米粒子有较好的单分散性。

(2)纳米羟基磷灰石对人肝癌细胞系Bel-7402的生长具有明显的抑制作用。

(3)纳米羟基磷灰石通过进入到癌细胞内，影响细胞周期，使Bel-7402细胞阻滞于G1期，从而抑制癌细胞的增殖。

【参考文献】

1 H.Aoki. Medical applications of hydroxyapatite. Tokyyo，Takayama Press，1994，14-20.

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3 冯凌云，闫玉华，陈闻杰，等. 羟基磷灰石溶胶对W-256癌肉瘤细胞内钙离子浓度及细胞形态结构的影响. 中国生物医学工程学报，1998，17(4)：374-377.

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5 Feng Lingyun，Yan Yuhua，Shipu Li，et al. Synthesis of HAP-sol by ultrasonic irradiation and its acute toxicity research. the Third Far-Eastern Symposium on Biomedical Materials，Chengdu：Kobunshi Kankokai Press，1997，158-159.

6 冯凌云，李世普，陈闻杰，等. 羟基磷灰石溶胶及其对瘤细胞增殖的影响. 中国有色金属学报，1999，9(3)：651-654.

7 曹献英，李世普，闫玉华，等. 羟基磷灰石超微粉对肝癌抑制作用的实验研究. 2000-C-MRS. 北京： 化学工业出版社，2000，372-375.

8 Feng Lingyun，Li Shipu，Yan Yuhua，et al. Inhibition of HAP nanoparticles on W-256 sarcoma of rats in vivo. Chinese J. of Biomedical Engineering，2001，302-306.

9 曹献英，李世普，闫玉华，等. 二氧化钛纳米粒子对人肝癌细胞抑制作用的实验研究. 中华医药杂志，2002，2（10）：865-867.

基金项目：湖北省科技攻关重大项目（2002AA105A）

作者单位： 1 570228 海南海口，热带海洋与陆生生物资源研究及利用教育部重点实验室

2 570228 海南海口，海南大学理工学院

3 430070 湖北武汉，武汉理工大学生物材料与工程中心

4 430070 湖北武汉，武汉理工大学第一医院

(编辑：罗 彬)