高温和当归联合作用对HeLa细胞周期的影响

【摘要】 目的 观察高温和当归联合作用对HeLa细胞周期的影响。方法 采用流式细胞仪检测高温和当归注射液联合作用对HeLa细胞凋亡及细胞周期的影响。结果 单一高温作用后主要表现为细胞凋亡和G1期阻滞，当归注射液作用后主要表现为G1期阻滞和S期减少，两者联合作用后对细胞周期的影响表现了高温和当归注射液的双重特点。结论 应用高温和中药联合治疗可能是提高肿瘤治愈率有效方式之一。

【关键词】 高温；当归；HeLa细胞；细胞周期；流式细胞术

Influence of cell cycle by unification of hyperthermia and angelica in HeLa cell cycle

LIU Yu-wei,WEN Ruo-jian,YI Hui-ling.

Institute of Oncology,Jianghan University,Wuhan,Hubei 430056,China

【Abstract】 Objective To approach the influence of cell cycle by unification of hyperthermia and angelica injection in HeLa cell. Methods The influence of apoptosis and cell cycle of HeLa cell were measured by flow cytometry. Results Hyperthermia induced apoptosis and G1 phase arresting. Cell cycles were arrested at G1 phase and cells decrease of S phase by angelica injection. Double features were showed by unification of these two methods. Conclusion Unification of hypertherimia and Traditional Chinese Medicine probably is one of an effective methods of curing for tumors.

【Key words】 hyperthermia; angelica; HeLa cells, cell cycle; flow cytometry

高温作为一种肿瘤治疗手段，对肿瘤细胞周期具有明显的影响，进而影响到其DNA复制，导致细胞凋亡或死亡。当归为常用中药，是伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，性温味甘辛，入心肝脾三经，主要功用为补血和血、调经止痛、润燥滑肠之功效，在临床上用途十分广泛，有“十方九归”之说。近年来，当归的抗肿瘤研究多有报道[1,2]。作为2种重要的肿瘤治疗手段，许多学者均对此做了广泛的研究，但其联合作用对肿瘤细胞周期的影响却未见报道。本文以人宫颈癌细胞（HeLa细胞）为细胞模型，观察了高温和当归联合作用对其凋亡和细胞周期的影响，旨在为肿瘤治疗提供新的思路和实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药物 RPMI-1640培养基、小牛血清（Gibco）、碘化吡啶（PI）（Sigma）、当归注射液（生药含量0.05g/ml，规格：2ml/支，由山西永济市制药厂生产）。

1.2 细胞株 人宫颈癌细胞株（HeLa细胞）购自武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC，ATCC引进）。

1.3 主要仪器 自控式CO2孵育箱（型号：2300 Shellab公司）、超净工作台（型号：YJ-450苏州净化设备厂）、电热恒温水浴箱（型号：BS2 北京市医疗设备总厂），流式细胞仪（型号：FACScan Becton-Dickinson公司）。

1.4 细胞培养 HeLa细胞接种于含10%小牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，入37℃、5%CO2孵育箱培养，隔日传代。当传代后的细胞处于指数增生期时，收集细胞，制成2×107个/ml细胞悬液。

1.5 分组 实验分成37℃、40℃和43℃ 3个温度组，每组又设四个亚组，即零对照组和三个当归剂量组，将细胞悬液分装于Ep管中，每管中分别加入RPMI1640培养基及不同剂量的当归稀释液，致其终浓度分别为0、5、10和20mg/ml。分装后的细胞置于37℃，5%CO2培养箱中，稳定恢复30min。

1.6 加温 恒温水浴箱3个，预先将温度分别调至37℃、40℃和43℃，并稳定4h以上。将各组HeLa细胞分别置于相应温度的水浴恒温箱内，10min后开始计时。分别在1h、2h和4h后取出各亚组的Ep管，置于二氧化碳培养箱（37℃，5%CO2）内继续培养12h。

1.7 流式细胞仪检测细胞周期 将Ep管用1000r/min离心10min，PBS清洗，再离心、去上清，边振荡边加入1ml预冷的70%乙醇固定，入-20℃过夜。细胞悬液染色前先用PBS洗涤去除固定液，加入100μl RNase37℃水浴30min，再加入400μl碘化吡啶染色液混匀，置于4℃避光条件下染色30min，在流式细胞仪上检测HeLa细胞的凋亡率和细胞周期分布。

2 结果

2.1 一定温度条件下，加热不同时间，HeLa细胞的凋亡情况和细胞周期变化 37℃时，对照组细胞凋亡率及细胞周期分布无明显变化。A、B、C组分别代表当归浓度5、10和20mg/ml三个亚组。随着当归浓度的增加和作用时间的延长，HeLa细胞出现G1期阻滞和S期减少，并呈现出一定的量效和时效关系，见表1。

表1 37℃时，HeLa细胞的凋亡率及细胞周期分布（略）

40℃时，对照组细胞凋亡率及细胞周期分布无明显变化。随着当归浓度的增加和作用时间的延长，细胞出现明显的G1期阻滞，S期细胞进一步减少，呈现出量效和时效关系，见表2。

表2 40℃时，HeLa细胞的凋亡率及细胞周期分布（略）

43℃时，随着加温时间的延长，对照组细胞凋亡率有一定升高。随着当归浓度的增加和作用时间的延长，细胞凋亡率明显上升，G1和S期细胞均出现一定程度的减少，均呈现出一定的量效和时效关系，见表3。

表3 43℃时，HeLa细胞的凋亡率及细胞周期分布（略）

2.2 在不同温度条件下，HeLa细胞的凋亡情况和细胞周期变化 与37℃组比较，40℃组细胞出现明显的G1期阻滞，S和G2/M期细胞明显减少；43℃组细胞凋亡率明显上升，而G1期细胞分布较40℃条件下出现一定程度的减少，见表4。

表4 不同温度时，HeLa细胞的凋亡率及细胞周期分布（略）

3 讨论

细胞周期是指一个细胞经生长、分裂而增殖成2个细胞所经历的全过程, 通常可分为若干阶段, 即G1 期、S 期、G2 期和M期。细胞在G1期完成必要的生长和物质准备, 在S期完成其遗传物质--染色体DNA 的复制, 在G2 期进行必要的检查及修复以保证DNA 复制的准确性, 然后在M期完成遗传物质到子细胞中的均等分配, 并使细胞一分为二[3]。肿瘤是一类细胞周期性疾病，因此，细胞周期分析在肿瘤生物学领域的作用越来越显得重要。HeLa细胞是人类子宫颈癌细胞株，细胞处于活跃的增殖状态，我们的实验证明，温和性高温（40℃）作用主要引起HeLa细胞发生G1期滞留，约有75%左右的细胞停留在G1期，S期细胞数量明显减少，而当温度升高到43℃时，细胞周期受阻和高温的双重作用引发了凋亡程序导致细胞凋亡，可能主要引起G1期细胞的凋亡。而当归单独作用于HeLa细胞时，也会浓度依赖性地引起一定程度的G1期滞留。

而当这2种方法联合应用时，可以看到，细胞周期呈现出两者影响的双重特点。在40℃作用条件下，HeLa细胞被阻滞于G1期，细胞凋亡率有轻度上升，而在43℃作用条件下，随着温度的上升、加温时间的延长和当归注射液浓度的升高，HeLa细胞的凋亡率明显提高，表现出明显的时效和量效关系。而从数据来看，很可能主要引起G1期细胞的凋亡。这提示我们，应用高温和中药联合作用治疗可能是提高肿瘤治愈率有效方式之一。

细胞周期各期之间的转换，即细胞周期的进程，是受到精确控制的。细胞内的周期因子依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）控制着细胞周期各期之间的顺序转换，其活性由周期因子（Cyclin）激活。细胞周期中有两个主要的检查点，一个是G1/S，控制细胞从生长前期（G1期）进入DNA合成期（S期）；另一个是G2/M，是决定细胞一分为二的控制点[3,4]。我们的结果表明，40℃～43℃的高温和当归联合作用引起更多的HeLa细胞G1期阻滞，两者可能同时影响了细胞周期的第一个检查点即由G1期向S期转换的CDK和Cyclin致使HeLa细胞在凋亡率明显上升，其具体的机制还有待进一步研究。

【参考文献】

1 冯俊志, 赵国平. 当归的免疫药理研究进展. 福建中医药, 2003, 34（3）: 49.

2 夏泉, 张平, 李绍平, 等. 当归的药理作用研究进展. 时珍国医国药, 2004, 15（3）: 164.

3 姜宏华, 张一楚. 细胞周期调节因子与肿瘤. 国外医学·外科学分册, 2003，30（4）: 195.

4 Nigg EA. Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of eukaryotic cell cycle. Bio Essays, 1995，17: 471.

（编辑：宋 冰）

作者单位： 430056 湖北武汉，武汉江汉大学肿瘤研究所